Uso de la reacción en cadena de la polimerasa para caracterizar aislamientos nativos de Bacillus thurigiensis.

Abstract

En este estudio se estandarizó una metodología para la caracterización molecular de cepas nativas de Bacillus thurigiensis, la cual se basó en la aplificación de los genes cry mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se utilizarón 4 mezclas de oligonucleótidos: 2 generales (I y II), los cuales reconocen genes de las familias cry1, cry2, cry3, cry4 y cryIa, y 2 específicos (A y B), que identifican los genes de la familia cry1 (cry1Aa, cry1Ab, cryAc, cry1Ba, cry1Ca y cry1Da). La calidad y concentración del ADN bacteriano influyó sobre la especificidad y concentración de los productos obtenidos mediante la amplificación de los genes cry. La calidad del ADN purificado através del método rápido reportado por M. He et al. (Nucleic Ac. Res: 18:1660, 1990) permitió una amplificación eficiente. Para realizar la PCR en condicones óptimas, se utilizó una mezcla de reacción con un volumen final de 20 uL, la cual contenia 0,4 uM de cada oligonucleótido, 1X PCR buffer (50 mM KCL, 10mM Tris-HCL, pH 8,3 y 3,0 mM MgCl2), 200 uM de cada dNTP y 1U de Taq-ADN-polimerasa, ademas de 10-100 300-500 ng de ADN bacterial para las mezclas de los oligonucleotidos Generales y Específicos, respectivamente. El programa de amplificación incluyó 30 ciclos de desnaturalización a 94 grados centígrados, hibridación a 53 grados centígrados y síntesis a 72 grados centígrados durante 20 segundos cada uno. La metodología estandarizada se puede utilizar rutinariamente para amplificar los genes cry procedentes de aislamientos nativos de B. thurigiensis, lo cual permite clasificarlos y seleccionarlos de una manera rápida y precisa de acuerdo con su actividad biológica y potencial biotecnológico, adicionalmente, como paso previo de los ensayos de toxicidad contra diversas especies de insectos plaga de interés agrícola